异种肝移植的研究进展

窦科峰, 李霄, 杨佩军, 陶开山

2018, (5): 339-343. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.001

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异种移植相关功能蛋白人源化基因修饰猪模型的建立

刘琪帅, 李小平, 王可品, 葛维凯, 赖良学

2018, (5): 344-348. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.002

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异种肝移植手术前后移植肝差异表达基因的筛选及验证

李霄, 纪洪辰, 潘登科, 周亮, 窦科峰, 陶开山

2018, (5): 349-354. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.003

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目的探讨异种移植手术前后移植肝内差异表达基因的变化，并且进行筛选及验证。方法以 α-1，3- 半乳糖苷转移酶基因敲除（GTKO）小型猪为供体、藏酋猴为受体，完成 4 例异种脾窝辅助性肝移植手术。于供肝修整时切取适量术前标本，于移植肝开放血流后 48 小时以肝穿刺活检获得术后标本。对手术前后的移植肝标本进行 miRNAs 和 mRNAs 的高通量芯片分析，筛选出关键的差异表达 miRNAs 和 mRNAs，并进行实时定量 PCR 及 Western Blot 实验验证。结果与术前相比，有 165 个 miRNAs 在术后出现差异表达，其中上调分子 112 个，下调分子 53 个。筛选并验证 mi-23b 等 12 个出现显著差异表达的 miRNAs，除 miR-150 和 miR-126-3p 外，其他 miRNAs 的表达变化情况与 miRNAs 芯片结果基本相符。与术前相比，有 2 035 个 mRNAs 在术后出现显著差异表达，其中 922 个表达上调、1 113 个表达下调，筛选 IGFBP6、CDK2AP1、TNFAIP6、FⅦ、NKG2D 等 5 个生物学功能与肝脏移植密切相关的差异表达基因进行 mRNA 和蛋白水平验证。除 NKG2D 外，其他 4 个基因的蛋白水平表达变化与 mRNA 水平变化基本一致（均 P ＜ 0.05），但 CDK2AP1 的蛋白变化幅度较小，差异无统计学差异（P ＝ 0.073）。结论异种肝移植术后移植肝的 miRNAs 和 mRNAs 表达出现较大变化，这些差异表达基因可能与免疫损伤及凝血功能障碍有关。

五指山小型猪 - 藏酋猴异种肝移植的术前检测

白鸽, 李霄, 张虹, 黄敏, 陶开山, 窦科峰

2018, (5): 355-358. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.004

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目的本研究为了减少五指山小型猪 - 藏酋猴异种肝移植手术的超急性排斥反应（hyperacute rejection，HAR）和急性排斥反应（acute rejection，AR）发生率，进行全面术前检测。方法分别利用 PCR 技术和植物凝集素细胞染色对供体 GGTA1 基因敲除类型进行鉴定；30 只藏酋猴分别与五指山小型猪进行淋巴细胞毒实验；供受体 ABO 血型鉴定。结果供体为 GGTA1 基因敲除猪，GTKO 猪外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）植物凝集素细胞染色未检测出荧光，表明 GGTA1 基因敲除成功，与基因型鉴定结果一致。通过淋巴细胞毒实验选定 28# 与供体 PBMC 毒性最小的藏酋猴做为备选受体。血型鉴定显示供受体血型一致。结论通过对 GTKO 五指山小型猪 - 藏酋猴异种肝移植的术前检测选定合适的受体，可有效减少异种移植 HAR 和 AR 的发生率。

抑制性分子 LAIR-1 在异种移植物杀伤机制中的作用

张虹, 张卓超, 李霄, 黄敏, 张玄, 陶开山, 窦科峰

2018, (5): 359-362. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.005

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目的探讨 NK 细胞表面抑制性受体白细胞相关免疫球蛋白样受体 -1（eukocyte-associated immunoglobulin like receptor-1，LAIR-1）在异种移植免疫排斥反应中的作用。方法采用免疫组织化学染色检测异种移植术后供肝组织的免疫细胞浸润情况，酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测受体血浆中可溶性 LAIR-1（sLAIR-1）的表达，转录组测序检测受体免疫细胞表面膜型 LAIR-1（mLAIR-1）的表达。结果异种移植术后供肝组织受到淋巴细胞浸润，受体淋巴细胞表面 mLAIR-1 和 sLAIR-1 呈动态平衡状态。结论受体免疫细胞表面 mLAIR-1 和血浆中 sLAIR-1 的表达水平处于动态平衡的状态可能与受体发生免疫排斥反应相关，LAIR-1 有望成为移植术后诱导免疫耐受的分子。

原代猪肝细胞及主动脉内皮细胞的提取和培养

王权成, 陶开山, 李霄, 张玄, 白鸽, 王博, 窦科峰

2018, (5): 363-367. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.006

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目的建立有效高活力的原代猪肝细胞和主动脉内皮细胞提取和培养的方法。为异种移植排斥反应的靶细胞——血管内皮细胞和肝细胞的研究提供基础。方法从野生巴马猪分离肝脏和主动脉血管，通过蠕动泵灌注Ⅱ型胶原酶消化的方法提取猪肝细胞，低速离心和差速贴壁法纯化肝细胞，过碘酸雪夫（PAS）染色、白蛋白与肝细胞核因子 4α 免疫荧光染色对原代肝细胞进行鉴定；利用Ⅰ型胶原酶血管管腔灌注消化法提取猪主动脉内皮细胞，并通过检测因子Ⅷ相关抗原 vWF 及内皮细胞吞噬乙酰化低密度脂蛋白的方法进行鉴定。结果通过本文方法提取到了大量高活力的原代猪肝细胞和主动脉内皮细胞，猪肝细胞可以连续培养一周，内皮细胞可进行传代培养和冻存。两种细胞分别表达肝细胞和内皮细胞标志性蛋白。结论本研究提供的原代猪内皮细胞和肝细胞提取方法是制备大量高活力的原代内皮细胞及肝细胞的可靠方案。

人类间充质干细胞来源的外泌体对猪胰岛抗缺氧能力的影响

聂唯, 马小倩, 陈则夷, 杨策军, 容鹏飞, 王维,

2018, (5): 368-374. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.007

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目的探讨来自人类脐带源间充质干细胞条件培养基（human umbilical cord-derived MSCconditioned medium，Hu - MSC-CM）中的外泌体能否增加新生猪胰岛细胞（neonatal porcine islet cell clusters， NICCs）在缺氧环境下的生存和功能。方法 NICCs 在低氧条件下（1% O2）分别用含外泌体的条件培养基、去除外泌体的条件培养基和常规培养基进行培养。荧光激活细胞分选仪和细胞外通量测定法分别检测外泌体对细胞活性和功能的影响，实时定量 PCR 检测 NICCs 中缺氧耐受相关基因 HIF-1α、PDH2 及 VEGF 的表达。结果与常规培养基组和去除外泌体的条件培养基组相比，含外泌体的条件培养基组培养的 NICCs 其存活率、活性和功能均有所提高〔IEQ ：7 800±210 比 5 894±188、4 740±273，P ＜ 0.001 ；β 细胞存活率（%）：77.2±7.0 比 68.8±1.8、61.5±5.1，P ＜ 0.05〕。含外泌体的条件培养基组孵育的 NICCs 细胞中 HIF-1α、PDH2 及 VEGF 基因表达均显著高于另外两组。结论人类脐带源 MSC - 条件培养基可以减轻 NICCs 在缺氧过程中导致的功能障碍，外泌体在诱导低氧抵抗方面发挥重要作用。

流式细胞术检测供体猪 α-1，3-Gal 和人源CD46 的表达

杜敏杰, 魏静, 臧荣鑫, 潘登科,

2018, (5): 375-379. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.008

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目的检测基因修饰猪细胞表面 α-1，3- 半乳糖（α-Gal）抗原敲除情况和人源蛋白 CD46 （hCD46）的表达情况，为异种器官移植提供可靠的供体。方法采集 500 μl 野生型（wild type，WT）、 α-1，3- 半乳糖基转移酶基因敲除（GTKO）、hCD46 和 GTKO/hCD46 巴马小型猪血液，分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。异硫氰酸荧光素标记的植物凝集素（FITC-GSIB4）与 PBMC 共孵育后采用流式细胞术检测 α-Gal 抗原敲除情况，异硫氰酸荧光素标记的 hCD46 膜辅蛋白抗体（antiCD46-FITC）与 PBMC 共孵育后采用流式细胞术检测 hCD46 蛋白表达情况。结果 GTKO 和 GTKO/hCD46 巴马猪 PBMC 表面 α-Gal 检测呈阴性，WT 和 hCD46 巴马猪检测呈阳性，与测序结果一致；hCD46 和 GTKO/ hCD46 巴马猪 PBMC 表面 hCD46 蛋白检测呈阳性，WT 和 GTKO 巴马猪检测呈阴性，与 PCR 鉴定结果一致。结论建立了微量血液流式细胞术直观检测供体猪 α-Gal 抗原和人源 CD46 蛋白表达的方法。

重组人促红细胞生成素预处理减轻大鼠肝脏缺血 / 再灌注损伤

慕喜喜, 李静, 韩璐, 钟岳, 何大立, 窦科峰, 陶开山

2018, (5): 380-385. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.009

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目的探讨重组人促红细胞生成素（rhEPO）对大鼠肝脏缺血 / 再灌注损伤（IRI）的保护作用和机制。方法选取健康雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠 30 只，随机均分为实验组（rhEPO 组）、对照组及假手术组。rhEPO 组术前 1 小时通过尾静脉注射 5 000 U/kg 的 rhEPO，然后建立大鼠 70% 肝脏 IRI 模型。苏木素 - 伊红（HE）染色观察肝脏组织学变化；生化仪测定血清中天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的释放量；蛋白免疫印迹试验（Western Blot）检测 PI3K/AKT 蛋白磷酸化水平；qPCR 测定炎性细胞因子〔肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL-6 和 IL-1β）〕mRNA 的表达；酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 浓度。结果对照组有明显的肝组织损伤，血清中 AST 和 ALT 释放量均增加，而 rhEPO 组肝组织损伤程度较轻，转氨酶水平低于对照组〔AST（U/L）：582.0±52.5 比 245.0±31.7 ；ALT（U/L）：388.0±39.6 比 166.0±24.3，均 P ＜ 0.05〕。蛋白检测发现 rhEPO 组 p-p85 和 p-AKT 的表达显著增加，明显高于对照组。qPCR 提示 rhEPO 组炎性因子 TNF-α、IL-6 和 IL-1β mRNA 表达明显低于对照组。ELISA 亦证实 rhEPO 组血清中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 分泌低于对照组〔TNF-α （pg/ml）：425.0±31.2 比 227.0±19.7 ；IL-6（pg/ml）：353.0±26.4 比 189.0±16.3 ；IL-1β（pg/ml）： 511.0±39.6 比 328.0±23.2 ，均 P ＜ 0.05〕。结论 rhEPO 预处理能抑制大鼠肝脏 IRI 时炎性因子释放，保护肝组织，其机制可能与 PI3K/AKT 信号的进一步活化有关。

小鼠肝移植显微手术技巧及科研应用价值

宋卓伦

2018, (5): 385. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.010

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DCD 供肾摘取对手术室护士的影响

宗敏, 乔贝, 李利, 李威威, 陈辉, 杨坤, 李昂

2018, (5): 386-388. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.011

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大网膜生物支架胰岛细胞 - 肾联合移植的围术期护理

丁雪洁, 王靖

2018, (5): 389-391. DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.012

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